DNA甲基化檢測的控制

對照如何提高可靠性和可重復(fù)性？甲基化定性和定量檢測的對照：何時使用？為什么使用？以及如何使用？
所有科學(xué)實(shí)驗(yàn)都需要對照。某些類型的實(shí)驗(yàn)需要特定的對照，如 DNA甲基化檢測。DNA甲基化是一種功能強(qiáng)大、深入研究的表觀遺傳標(biāo)記，它不斷為轉(zhuǎn)錄調(diào)控、胚胎發(fā)育、基因組穩(wěn)定性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)提供廣泛的見解。DNA甲基化圖譜的變化還與許多疾病的發(fā)生有關(guān) 1。許多臨床應(yīng)用已將 DNA甲基化作為生物標(biāo)記，用于早期檢測、診斷和個人治療 2、3。這就需要對特定區(qū)域或單堿基水平的甲基化模式進(jìn)行準(zhǔn)確表征。

最常用的DNA甲基化檢測方法包括使用 NGS 技術(shù)進(jìn)行亞硫酸氫鹽測序、甲基化特異性 PCR（MSP）、甲基化特異性定量PCR(qMSP)、HRM和甲基化敏感性限制酶（MSRE）檢測。為了盡量減少甲基化水平量化的偏差，尤其是在臨床應(yīng)用中，每種檢測方法都需要精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以確保其穩(wěn)健性4。整合既有的控制方法是優(yōu)化檢測方法和監(jiān)測檢測效果的關(guān)鍵。要優(yōu)化DNA甲基化檢測，最好使用已知甲基化水平的既定 DNA標(biāo)準(zhǔn)。通常，這需要甲基化和非甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)，它們在所有 CpG 位點(diǎn)上分別含有近 100% 和 0% 的甲基化。單獨(dú)或結(jié)合使用這兩種標(biāo)準(zhǔn)有助于識別檢測開發(fā)中的潛在偏差。對于已建立的工作流程，這些標(biāo)準(zhǔn)品可作為陽性和陰性對照來驗(yàn)證程序和結(jié)果，這在臨床檢測中對加強(qiáng)質(zhì)量控制和保證至關(guān)重要。

驗(yàn)證DNA甲基化檢測工作流程的質(zhì)量控制

作為一種良好做法，甲基化和非甲基化標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與實(shí)驗(yàn)樣本同時處理，作為整個工作流程的質(zhì)量控制。與每次都能產(chǎn)生一致結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)品相比，實(shí)驗(yàn)樣本可能存在很多變數(shù)，從而導(dǎo)致故障排除困難。在基于 PCR、qPCR 和 NGS 的 DNA 甲基化檢測中，樣本中殘留的抑制劑、引物設(shè)計(jì)、酶試劑、儀器故障和許多其他因素都可能導(dǎo)致檢測失敗。標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可以建議從哪里開始排除故障。例如，如果標(biāo)準(zhǔn)品在與實(shí)驗(yàn)樣本同時運(yùn)行時表現(xiàn)符合預(yù)期，而實(shí)驗(yàn)樣本表現(xiàn)不佳，則說明工作流程運(yùn)行正常，表明實(shí)驗(yàn)樣本質(zhì)量可能存在問題。如果標(biāo)準(zhǔn)品的表現(xiàn)不盡如人意，則可能是工作流程內(nèi)部出現(xiàn)了問題，導(dǎo)致檢測失敗。

優(yōu)化和校準(zhǔn)亞硫酸氫鹽檢測的控制措施
亞硫酸氫鹽PCR (BSP) 是一種用于單堿基分辨率甲基化分析的常用方法。首先對樣本進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換，然后使用亞硫酸氫鹽特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。對生成的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序（如新一代測序、桑格測序、焦磷酸測序）和分析，以確定每個胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。然而，為 BSP 設(shè)計(jì)的引物對必須以相同的效率擴(kuò)增甲基化和非甲基化序列（圖 1）。否則，任何擴(kuò)增偏差都會導(dǎo)致甲基化水平偏差。

利用甲基化和非甲基化DNA對照，可根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)輕松優(yōu)化（驗(yàn)證）BSP 引物：

• 特異性產(chǎn)品擴(kuò)增
• 對甲基化和非甲基化 DNA 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行同樣穩(wěn)健的擴(kuò)增
• 測序時，甲基化和非甲基化 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的甲基化程度應(yīng)分別接近 100% 和 0%。如果結(jié)果與預(yù)期結(jié)果有偏差，則可能表明 PCR 存在偏差。

圖 1. 亞硫酸氫鹽 PCR 引物應(yīng)對甲基化、非甲基化或部分甲基化的模板進(jìn)行同樣有效的擴(kuò)增。使用針對 MGMT 設(shè)計(jì)的引物，在擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)樣本的同時擴(kuò)增等量的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的非甲基化和甲基化 DNA 對照。甲基化和非甲基化模板的觀察條帶強(qiáng)度相同，表明引物對是無偏的。

與亞硫酸氫鹽PCR(BSP)不同，甲基化特異性PCR（MSP）要求甲基化和非甲基化模板通過兩組不同的引物進(jìn)行不同的擴(kuò)增。其中一組是甲基化特異性引物，如果發(fā)生擴(kuò)增，則表明擴(kuò)增區(qū)域完全甲基化。第二組引物針對的是非甲基化模板，因此用這組引物進(jìn)行的任何擴(kuò)增都表明擴(kuò)增區(qū)域是完全非甲基化的。如果兩組引物都產(chǎn)生擴(kuò)增子，則說明該區(qū)域部分甲基化。

MSP所需的這兩組引物也可利用甲基化和非甲基化 DNA 對照進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，具體方法如下：

• 特定產(chǎn)物擴(kuò)增
• 甲基化引物只擴(kuò)增甲基化對照 DNA，不擴(kuò)增非甲基化 DNA。
• 非甲基化引物只會擴(kuò)增非甲基化對照 DNA，不會擴(kuò)增甲基化 DNA。

在引物驗(yàn)證過程中，獨(dú)具特性的甲基化和非甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)可以簡化過程。例如，如果使用甲基化標(biāo)準(zhǔn)品和非甲基化引物觀察到輕微的PCR信號，或反之亦然，則表明引物組是非特異性的。對于已建立的工作流程，尤其是臨床檢測，甲基化和非甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)品可作為陽性和陰性對照，以驗(yàn)證 MSP 工作流程。標(biāo)準(zhǔn)品有助于確認(rèn)整個流程即亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換、擴(kuò)增和分析是否正常運(yùn)行，以及檢測樣本的結(jié)果是否可靠（圖 2）。

圖 2. 甲基化和非甲基化對照對驗(yàn)證 MSP 檢測的靈敏度非常重要。甲基化和非甲基化對照分別只被甲基化和非甲基化引物擴(kuò)增。樣本 1 同時被兩組引物擴(kuò)增，表明存在混合甲基化。樣品在 Agilent D100 ScreenTape 上進(jìn)行分析。

除了驗(yàn)證引物外，還可以用 DNA標(biāo)準(zhǔn)品代替珍貴樣本來優(yōu)化新引物組的退火溫度（圖 3）。每套新設(shè)計(jì)的引物都應(yīng)進(jìn)行退火溫度梯度處理，以確保預(yù)期目標(biāo)的最佳擴(kuò)增效果。

圖 3. 通過測試退火溫度為 58°C 至 64°C 的重復(fù) PCR 反應(yīng)，優(yōu)化了針對 MGMT 的引物對。

甲基化敏感限制酶（MSRE）檢測的控制措施
甲基化敏感限制酶（MSRE）檢測依賴于限制酶能夠區(qū)分甲基化和非甲基化胞嘧啶。如果限制性位點(diǎn)沒有甲基化，酶就會消化DNA，而甲基化位點(diǎn)則不會被切割。然后，通過比較已消化樣本與未消化樣本的擴(kuò)增情況，可使用qPCR 評估該位點(diǎn)的甲基化情況。兩者之間的 ?C(t) 越小，甲基化水平越高，反之亦然（圖 4）。DNA 可視化方法（如瓊脂糖凝膠電泳分析）也可用于確定消化是否發(fā)生在相關(guān)區(qū)域。甲基化和非甲基化 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與實(shí)驗(yàn)樣本同時消化，以證明限制性酶在區(qū)分甲基化和非甲基化位點(diǎn)時的穩(wěn)健性。這也有助于確定檢測對相關(guān)區(qū)域的敏感性。

圖 4. 擴(kuò)增曲線顯示了消化樣本和未消化樣本的 Ct 值差異。MSRE 檢測法在甲基化和非甲基化 DNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品中分別檢測到 100.9% 和 2.7% 的甲基化，證實(shí)檢測法有效。檢測樣本的甲基化水平被確定為 17.3。

用于其他應(yīng)用的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品
DNA 標(biāo)準(zhǔn)品可用于優(yōu)化各種其他應(yīng)用，因?yàn)樗蔷哂幸阎谆Ｊ降母哔|(zhì)量基因組DNA。因此，在滴定實(shí)驗(yàn)條件時，它們是珍貴 DNA 或問題樣本類型的理想替代品。例如，在優(yōu)化 FFPE DNA 的亞硫酸氫鹽文庫制備時，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品可以很容易地進(jìn)行超聲處理或破碎，以代表實(shí)驗(yàn)樣本。

甲基化和非甲基化 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品已被用作多種甲基化檢測的對照：

• 甲基化檢測 5, 6
• 甲基化敏感的高分辨率熔體分析 7-9
• 焦磷酸測序 10, 11
• 甲基化陣列 12
• 甲基化 DNA 免疫沉淀 13
• 亞硫酸氫鹽測序文庫制備 14

人類甲基化和非甲基化 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品是用于人類樣本甲基化分析的有效對照組。它們已被廣泛應(yīng)用于上述所有檢測及其他檢測。我們還提供一系列其他 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品，可用于其他檢測方法的優(yōu)化或質(zhì)量控制，以確保您的數(shù)據(jù)具有最高質(zhì)量，可隨時發(fā)表。

References:
1. Robertson, K. D., DNA methylation and human disease. Nat Rev Genet 2005, 6 (8), 597-610.
2. Roy, D.; Tiirikainen, M., Diagnostic Power of DNA Methylation Classifiers for Early Detection of Cancer. Trends Cancer 2020, 6 (2), 78-81.
3. Wick, W.; Weller, M.; van den Bent, M.; Sanson, M.; Weiler, M.; von Deimling, A.; Plass, C.; Hegi, M.; Platten, M.; Reifenberger, G., MGMT testing--the challenges for biomarker-based glioma treatment. Nat Rev Neurol 2014, 10 (7), 372-85.
4. Hernández, H. G.; Tse, M. Y.; Pang, S. C.; Arboleda, H.; Forero, D. A., Optimizing methodologies for PCR-based DNA methylation analysis. Biotechniques 2013, 55 (4), 181-97.
5. Olkhov-Mitsel, E.; Zdravic, D.; Kron, K.; van der Kwast, T.; Fleshner, N.; Bapat, B., Novel multiplex MethyLight protocol for detection of DNA methylation in patient tissues and bodily fluids. Sci Rep 2014, 4, 4432.
6. Delgado-Cruzata, L.; Vin-Raviv, N.; Tehranifar, P.; Flom, J.; Reynolds, D.; Gonzalez, K.; Santella, R. M.; Terry, M. B., Correlations in global DNA methylation measures in peripheral blood mononuclear cells and granulocytes. Epigenetics 2014, 9 (11), 1504-10.
7. Ribeiro Ferreira, I.; Darleans Dos Santos Cunha, W.; Henrique Ferreira Gomes, L.; Azevedo Cintra, H.; Lopes Cabral Guimarães Fonseca, L.; Ferreira Bastos, E.; Clinton Llerena, J.; Farias Meira de Vasconcelos, Z.; da Cunha Guida, L., A rapid and accurate methylation-sensitive high-resolution melting analysis assay for the diagnosis of Prader Willi and Angelman patients. Mol Genet Genomic Med 2019, 7 (6), e637.
8. Raji?, J.; Inic-Kanada, A.; Stein, E.; Dini?, S.; Schuerer, N.; Uskokovi?, A.; Ghasemian, E.; Mihailovi?, M.; Vidakovi?, M.; Grdovi?, N.; Barisani-Asenbauer, T., Infection Is Associated with E-Cadherin Promoter Methylation, Downregulation of E-Cadherin Expression, and Increased Expression of Fibronectin and α-SMA-Implications for Epithelial-Mesenchymal Transition. Front Cell Infect Microbiol 2017, 7, 253.
9. Rawluszko, A. A.; Bujnicka, K. E.; Horbacka, K.; Krokowicz, P.; Jagodziński, P. P., Expression and DNA methylation levels of prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, PHD3 and asparaginyl hydroxylase FIH in colorectal cancer. BMC Cancer 2013, 13, 526.
10. Sparago, A.; Verma, A.; Patricelli, M. G.; Pignata, L.; Russo, S.; Calzari, L.; De Francesco, N.; Del Prete, R.; Palumbo, O.; Carella, M.; Mackay, D. J. G.; Rezwan, F. I.; Angelini, C.; Cerrato, F.; Cubellis, M. V.; Riccio, A., The phenotypic variations of multi-locus imprinting disturbances associated with maternal-effect variants of NLRP5 range from overt imprinting disorder to apparently healthy phenotype. Clin Epigenetics 2019, 11 (1), 190.
11. Yu, W.; Qin, X.; Jin, Y.; Li, Y.; Santiskulvong, C.; Vu, V.; Zeng, G.; Zhang, Z.; Chow, M.; Rao, J., Tianshengyuan-1 (TSY-1) regulates cellular Telomerase activity by methylation of TERT promoter. Oncotarget 2017, 8 (5), 7977-7988.
12. Van der Auwera, I.; Yu, W.; Suo, L.; Van Neste, L.; van Dam, P.; Van Marck, E. A.; Pauwels, P.; Vermeulen, P. B.; Dirix, L. Y.; Van Laere, S. J., Array-based DNA methylation profiling for breast cancer subtype discrimination. PLoS One 2010, 5 (9), e12616.
13. Rauen, T.; Grammatikos, A. P.; Hedrich, C. M.; Floege, J.; Tenbrock, K.; Ohl, K.; Kyttaris, V. C.; Tsokos, G. C., cAMP-responsive element modulator α (CREMα) contributes to decreased Notch-1 expression in T cells from patients with active systemic lupus erythematosus (SLE). J Biol Chem 2012, 287 (51), 42525-32.
14. Zheleznyakova, G. Y.; Nilsson, E. K.; Kiselev, A. V.; Maretina, M. A.; Tishchenko, L. I.; Fredriksson, R.; Baranov, V. S.; Schiöth, H. B., Methylation levels of SLC23A2 and NCOR2 genes correlate with spinal muscular atrophy severity. PLoS One 2015, 10 (3), e0121964.