熒光偏振（FP）技術(shù)測量的是樣品中熒光示蹤劑發(fā)射的光偏振變化，與測量特定波長發(fā)射光強度的熒光強度截然不同。FP 廣泛用于監(jiān)測溶液中的分子相互作用，因為它很容易適用于高通量格式和篩選應(yīng)用。FP 是一種復(fù)雜的技術(shù)，需要精心設(shè)計，并使用特定的儀器（帶有熒光濾光片的平板讀取儀，能夠進行偏振光激發(fā)并捕捉兩個平面上的發(fā)射光）。本說明探討了該技術(shù)的基本原理和基于 FP 的實驗。

熒光偏振（FP）原理
在 FP 技術(shù)中，熒光染料被偏振光激發(fā)。雖然初始光源會向各個方向發(fā)光，但偏振器會過濾光線，將其限制在沿傳播方向的單一平面內(nèi)。當熒光染料被單平面偏振光激發(fā)時，它會重新向所有方向發(fā)射光（即對激發(fā)光去偏振），因為它在激發(fā)和發(fā)射之間會移動和旋轉(zhuǎn)。分子旋轉(zhuǎn)是由于布朗運動造成的，這種運動在納秒內(nèi)發(fā)生，光的去極化程度與這種運動成正比。事實上，當溫度升高加速布朗運動時，熒光團再次發(fā)射的光的偏振會減弱，而當溶劑粘度升高減緩熒光團的運動時，偏振會增強。同樣，隨著熒光團尺寸的增大，布朗運動也會減弱，從而增加偏振的保持率（FP 的歷史和理論基礎(chǔ)見 [1]）。

因此，熒光探針的光偏振程度與布朗運動成反比。因此，F(xiàn)P 受改變分子旋轉(zhuǎn)和隨機運動的所有參數(shù)的影響，如大小、形狀（球體旋轉(zhuǎn)更快）、溶劑粘度和溫度。當溫度和粘度保持不變時，大小成為驅(qū)動 FP 的主要因素，F(xiàn)P 與熒光探針的大小成正比。

總而言之，熒光探針的極化程度是一個術(shù)語，表示激發(fā)光保持極化的程度。當一個小的熒光團被偏振光激發(fā)時，它的運動速度很快，會向各個方向重新發(fā)光：它會使激發(fā)光去極化，偏振程度很低。相反，被偏振光激發(fā)的大熒光團的重新定向是有限的：再發(fā)射時大部分光仍是偏振的，偏振程度高。

在實驗中，F(xiàn)P 技術(shù)測量的是熒光團在相對于激發(fā)平面平行和垂直的兩個光平面上發(fā)射的熒光強度。熒光偏振程度 (P) 的定義是：相對于激發(fā)平面平行和垂直的熒光強度之差除以總熒光強度：

I_‖ = 平行于激發(fā)平面的熒光強度

I_┴ = 垂直于激發(fā)平面的熒光強度

大多數(shù)儀器以 mP 為單位顯示熒光偏振，其中 1 mP = 1000 P

由于 (P) 是光強的比值，因此它是一個沒有維度的數(shù)字。理論 (P) 值范圍為 -0.33 至 0.5（-330 至 500 mP）。實驗數(shù)據(jù)通常從 10 mP 到 300 mP 左右不等。儀器可以實現(xiàn)非常精確的測量（P ± 0.002 或 ± 2 mP）。上式假定光在平行和垂直通道中的傳輸效果相同。實際情況并非如此，必須進行修正。校正因子稱為 "G 因子"。

G 因子與儀器有關(guān)，需要由研究人員確定。儀器手冊將包含如何確定 G 因子的信息。

熒光偏振(PF)檢測
熒光偏振(PF)檢測法測量小熒光團與大熒光團相互作用或解離時發(fā)生的光偏振變化。任何能與熒光團共價標記并能與較大伙伴形成復(fù)合物的小分子都適用于熒光偏振(PF)。

要成功地進行實驗，必須進行幾種控制：

"空白 "含有緩沖液和溶劑，但不含示蹤劑或結(jié)合伴侶。它測量的是試劑產(chǎn)生的微量自發(fā)熒光，應(yīng)低于 "參照物"。所有測量結(jié)果都要減去它。
"參考 "是一種內(nèi)部對照，含有示蹤劑，但不含結(jié)合伴侶。它是實驗條件允許的最低 FP，因為所有熒光示蹤劑都以游離形式存在。
"高熒光系數(shù) "是實驗條件允許的最高熒光系數(shù)的內(nèi)部對照，其中大部分或全部熒光示蹤劑都以結(jié)合態(tài)存在。在許多（但不是所有）類型的檢測中，這與 "陽性對照 "相同。
"陽性對照 "是實驗對照。例如，如果測試的是抑制劑，那么陽性對照就是沒有抑制劑的狀態(tài)。
 根據(jù)實驗設(shè)置和檢測類型，如果 "高 FP "對照與陽性對照相同，則可以省略。

實際測量和計算
在使用同一臺儀器進行所有實驗時，用戶可以忽略 G 因子，因為它與儀器有關(guān)。

如果需要，可在測量前設(shè)置 G 因子。如果制造商沒有明確說明，則需要由研究人員確定。儀器手冊中會包含如何設(shè)置 G 因子的信息。例如，BPS Bioscience 的科學(xué)家使用的 Tecan 熒光平板閱讀器的 G 值設(shè)置為 22 mP。

儀器提供毫偏振 = mP 的測量值（如上所述，這是兩個光偏振面上兩次測量值的比值，由儀器直接計算）。

結(jié)果計算如下

從所有其他值中減去空白值
計算所有樣品的 ΔmP：
ΔmP = (樣品的 mP 值) - (參照對照的 mP)

其中，mP 是指儀器提供的毫極化值，參考對照是指在僅含有熒光探針的條件下（探針處于自由狀態(tài)）獲得的 mP 值。

熒光偏振(PF)應(yīng)用
只要較小的實體能被熒光標記，F(xiàn)P 就適用于涉及兩個實體的分子結(jié)合的任何實驗，其中一個實體比另一個小得多[2]。建立競爭或抑制測定法相當簡單；蛋白水解和其他酶測定法也已開發(fā)出來。開發(fā) FP 檢測的一般程序見 [3]。

抗體與小抗原或表位的結(jié)合
受體-配體和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-RNA 相互作用
酶促反應(yīng)：底物與酶結(jié)合或形成新產(chǎn)物
蛋白質(zhì)分解
形成新產(chǎn)物，使用特定熒光珠進行區(qū)分。例如，使用針對磷酸化產(chǎn)物的特異性熒光抗體測量磷酸化程度
檢測特定的 PCR 產(chǎn)物 [4].
示蹤劑被置換的競爭研究，EC50 的測定
高通量篩選小分子抑制劑
篩選α-突觸核蛋白寡聚化抑制劑 [5]
肌肉功能研究 [6］

熒光偏振(PF)優(yōu)勢與局限
盡管 FP 檢測方法的開發(fā)很復(fù)雜，但設(shè)計精良的檢測方法使用簡單，而且非常適合高通量格式。以下是使 FP 檢測法特別具有吸引力的幾個特點。

熒光偏振(PF)優(yōu)點

溶液內(nèi)
耐受極小體積
均勻，無需清洗步驟
無放射性
實時
與熒光強度檢測法相比，對染料的依賴性較低，不易受 pH 值干擾
熒光偏振(PF)局限性

無動力學(xué)常數(shù)
如果熒光標簽設(shè)計不當，可能會改變示蹤劑的結(jié)合特性
對溫度變化敏感

考慮因素
干擾不大的因素

緩沖液 pH 值
染料濃度
顏色添加劑

熒光偏振(PF)關(guān)鍵因素：

尺寸變化是最關(guān)鍵的因素，最好是系數(shù)≥5 倍的變化。差異越大，測量結(jié)果越可靠。
熒光分子具有激發(fā)態(tài)，分子保持激發(fā)態(tài)的時間越長，旋轉(zhuǎn)的幅度就越大。這不會影響測量，因為這是熒光團的固有特性，在整個實驗過程中保持不變。不過，這也會影響熒光團的選擇，因為穩(wěn)定的熒光團可以實現(xiàn)更穩(wěn)健的測量。
檢測的性能取決于標記對小示蹤劑生物活性的破壞程度。熒光團的選擇是一個關(guān)鍵因素。驗證對于確保標記不改變示蹤劑與相關(guān)分子的相互作用或不影響所研究的酶反應(yīng)至關(guān)重要。
示蹤劑的標記率應(yīng)大于 90%，游離染料應(yīng)去除。如果仍有很高比例的示蹤劑未被標記，它將與標記的示蹤劑競爭結(jié)合，從而改變表觀 IC50。如果不去除游離染料，就會產(chǎn)生高背景信號，從而降低檢測靈敏度。
成分的純度會影響檢測質(zhì)量。大分子（如細胞或膜碎片）可能會對光散射造成潛在干擾，因此伴侶蛋白必須純凈。因此，粗細胞裂解液或細胞培養(yǎng)上清液必須是純凈的。

結(jié)論
我們提供經(jīng)過驗證的基于FP技術(shù)的系列檢測試劑盒，省去了許多優(yōu)化步驟，如實驗設(shè)計、熒光示蹤劑的標記和驗證或緩沖液成分，從而為科學(xué)家節(jié)省了時間和金錢。我們的試劑盒含有高質(zhì)量的純化蛋白，并附有經(jīng)過驗證的實驗方案。

參考文獻：

(1) Jameson DM, Croney JC. 2003 Comb Chem High Throughput Screen. 6(3): 167-173. PMID: 12678695.

(2) Hendrickson OD, et al. 2020 Sensors 20(24): 7132. PMID: 33322750.

(3) Moerke NJ. 2009 Curr Protoc Chem Biol. 1(1): 1-15. PMID: 23839960.

(4) Kido C, et al. 2000 Gene 259(1-2): 123-127. PMID: 11163969.

(5) Luk KC, et al. 2007 Biochemistry 46(44): 12522-12529. PMID: 17927212.

(6) Nihel T, et al. 1974 Proc Natl Acad Sci U S A. 71(2): 274-277. PMID: 4521799.